一、 稀釋甲型流感病毒H1亞型檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以陽性對照10E1-10E6拷貝/mL這6個10倍稀釋度）。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分。 1. 標(biāo)記6個離心管，分別為A6，A5，A4，A3，A2，A1。 2. 在A1-A6號管中各加入45 mL熒光PCR專用模板稀釋液。 3. 在A6號管中加入5 mL 1×10E7拷貝/mL的陽性對照（試劑盒提供），充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線PC樣品。放冰上待用。 4. 換槍頭，在A5號管中加入5 mL 1×10E6拷貝/mL的陽性對照（上步稀釋所得），充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。 5. 換槍頭，在A4號管中加入5 mL 1×10E5拷貝/mL的陽性對照（上步稀釋所得），充分震蕩1分鐘，得1×10E4拷貝/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。 6. 重復(fù)上面的操作得到A1-A6共六個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線陽性樣品。放冰上待用。 二、稀釋甲型流感病毒N1亞型檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品 7. 操作同上，只是使用甲型流感病毒N1亞型的PC作為模板。得到6個濃度的樣本放冰上待用，分別是B1-B6。 三、樣品RNA的制備 8. 如果有N個樣品，最好設(shè)置N+3個提取，多出的一個是甲型流感病毒H1亞型的PC（樣品制備陽性對照），一個是甲型流感病毒N1亞型的PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?0 mL第一步和第二步所得的4號稀釋液再加上一定量的水使總體積跟樣本制備試劑盒所要求的起始樣本體積一樣，以此分別作為兩個PC。另外用水作為NC，水的總體積需要跟樣本制備試劑盒所要求的樣本體積一樣。注意：本試劑盒采用DNA作為陽性對照，不能有效監(jiān)控核酸純化和RT過程。如果需要RNA模板，需要另外定做。 9. 用自選方法純化樣品的RNA。本試劑盒跟市場上大多數(shù)RNA提取試劑盒兼容，也可以選購本公司的免提取核酸釋放劑。 三、Probe qRT-PCR反應(yīng)（20 mL體系，在樣品制備室進(jìn)行） 10. 如果做定量分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+3+1+6+6個RT-PCR管，其中N+3個用于上步得到的N+3個樣品，1個用于RT-PCR陰性對照（用水做模板），6個用于甲型流感病毒H1亞型的標(biāo)準(zhǔn)曲線，另外6個用于甲型流感病毒N1亞型的標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+3+3個RT-PCR管，其中N+3個用于上步得到的N+3個樣品，1個用于RT-PCR陰性對照（用水做模板），1個用于甲型流感病毒H1亞型RT-PCR陽性對照，1個用于甲型流感病毒N1亞型RT-PCR陽性對照（直接用第一步和第二步所得的兩個4號稀釋液作為模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。 11. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)）： 成分 | 樣品管 N+3個 | RT-PCR陰性對照 | 標(biāo)曲樣品管 （A1-A6） | 標(biāo)曲樣品管 （B1-B6） | 探針法qRT-PCR緩沖液 | 各10 mL | 10 mL | 各10 mL | 各10 mL | 探針法qRT-PCR酶混合液 | 各2 mL | 2 mL | 各2 mL | 各2 mL | 甲型流感病毒H1N1亞型RT-PCR引物-探針混合液 | 各4 mL | 4 mL | 各4 mL | 各4 mL | N+3個待測RNA | 各4 mL | 不加 | 不加 | 不加 | 超純水 | 不加 | 4 mL | 不加 | 不加 | 第一步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線 樣品稀釋液（A1-A6號） | 不加 | 不加 | 各4 mL（A2號樣到A2號管，A3號樣到A3號管…） | 不加 | 第二步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線 樣品稀釋液（B1-B6號） | 不加 | 不加 | 不加 | 各4 mL（B2號樣到B2號管，B3號樣到B3號管…） |
12. 蓋上蓋子后上機，按下面參數(shù)進(jìn)行RT-PCR： 過程 | 溫度 | 時間 | 逆轉(zhuǎn)錄 | 50℃ | 15 min | 預(yù)變性 | 95℃ | 10 min | RT-PCR反應(yīng) （45個循環(huán)） | 94℃ | 30 sec | 60℃ | 60 sec（采集FAM通道和HEX通道兩個通道的熒光信號， 淬滅基團(tuán)均為TAMRA） |
四、數(shù)據(jù)處理 13. 如果擴(kuò)增陽性對照或制備陽性對照結(jié)果為陰性，則整個擴(kuò)增或制備實驗無效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要重做擴(kuò)增或制備或跟廠家聯(lián)系。如果擴(kuò)增陰性對照或制備陰性對照結(jié)果為陽性，說明環(huán)境污染，則整個擴(kuò)增或制備實驗無效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要跟廠家聯(lián)系，購買新的引物和探針。 14. 如果陰性對照和陽性對照正常，則實驗有效，可以進(jìn)入后續(xù)分析。 15. 對定量檢測，以標(biāo)曲樣本濃度的log值為橫軸，分別以甲型流感病毒H1亞型陽性對照（FAM通道）和甲型流感病毒N1亞型陽性對照（HEX通道）的Ct值為縱軸，繪制兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線，r2必須大于0.95。再以待測樣品的Ct值從分別從兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出對應(yīng)樣品RNA濃度的log值，再推算出其濃度。 16. 對定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照FAM通道的Ct必須大于或等于40。陽性對照FAM通道的熒光信號必須有對數(shù)增長，有典型擴(kuò)增曲線，Ct值應(yīng)該小于或等于35。對待測樣品，如果其FAM通道的Ct大于或等于40則為甲型流感病毒H1亞型陰性，如果小于或等于35則為甲型流感病毒H1亞型陽性。如果其HEX通道的Ct大于或等于40則為甲型流感病毒N1亞型陰性，如果小于或等于35則為甲型流感病毒N1亞型陽性。如果在35-40之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實驗的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽性。 | 
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